W poszukiwaniu lepszych metod leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów

Reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) to choroba autoimmunologiczna, charakteryzująca się stanem zapalnym stawów, która prowadzi do ograniczonej funkcjonalności i niepełnosprawności. Szereg prac wskazuje na cytrulinację, enzymatyczną modyfikację białek, katalizowaną przez rodzinę deiminaz peptydyloargininy (PAD), jako na istotny czynnik w rozwoju RZS. Niestety, podstawowe aspekty związane z cytrulinacją i biologią enzymów PAD pozostają niewyjaśnione. Nasz projekt podejmuje próbę opisania mechanizmów biologicznych aktywacji PAD, wykorzystując techniki biochemii, stosując linie komórkowe i analizując próbki pacjentów cierpiących na RZS.
dr Tomasz Kantyka, fot. Michał Łepecki

Charakterystyczną cechą RZS jest napływ komórek immunologicznych do stawów. Wśród nich przeważają neutrofile i makrofagi, a towarzyszą im limfocyty T i B. Pierwsze z nich napędzają proces zapalny i prowadzą do destrukcji tkanek. Limfocyty rozpoznają nowopowstałe białka cytrulinowane i produkują przeciwciała, które atakują własne białka pacjenta. Znaczącą grupę pośród tych przeciwciał stanowią tzw. ACPA, skierowane przeciwko cytrulinowanym: białkom budującym chrząstki, enzymom metabolicznym i białkom jądrowym. ACPA są wykrywane nawet przed wystąpieniem objawów klinicznych choroby, a ich poziom związany jest z postępem destrukcji stawów.

Cytrulinacja jest modyfikacją białek, w której dodatnio naładowany łańcuch argininy ulega modyfikacji do neutralnej cytruliny, aminokwasu niekodowanego w DNA. Modyfikacja ta jest krytyczna dla wytworzenia ACPA, ponieważ takie modyfikowane sekwencje często stanowią podstawę tzw. neoepitotów; lokacji w białkach organizmu, atakowanych przez układ immunologiczny. Grupa enzymów katalizujących cytrulinację (PAD) jest więc fundamentalna dla regulacji stanu zapalnego wywołanego obecnością neutrofili.

Podstawowymi regulatorami aktywności PAD są jony wapnia. Wiązanie wapnia, prowadzi do aktywacji enzymu w tzw. mechanizmie „przełącznika wapniowego”. Mechanizm ten pozwala na szereg zmian strukturalnych, prowadzących do uruchomienia maszynerii katalitycznej enzymu. Jednak stężenia wapnia wskazywane w tych badaniach wielokrotnie przekraczają poziomy wykrywane w warunkach fizjologicznych. Postuluje się, że w regulacji aktywności PAD uczestniczą również inne aktywatory, które albo zastępują wapń w mechanizmie aktywacji, albo prowadzą do zmniejszenia wymagań co do stężenia wapnia.

dr Tomasz Kantyka, fot. Michał Łepecki
Przełomowe wyniki uzyskane podczas realizacji naszego projektu wskazują na aktywację enzymu PAD4 przez naturalne cząsteczki z grupy glukozaminoglikanów (GAG). Substancje te pozwalają na aktywację PAD4 w stężeniach jonów wapnia zbliżonych do poziomów fizjologicznych, wyjaśniając możliwość ich działania in vivo. Rezultaty te zostały potwierdzone z wykorzystaniem szeregu technik, takich jak analiza aktywności enzymatycznej, bezpośrednie wyznaczenie oddziaływania GAG-PAD4 z wykorzystaniem mikrokalorymetrii MST, czy też wiązania określonego z wykorzystaniem techniki rezonansu plazmonowego SPR. Wyniki te potwierdzają wiązanie GAG o wysokim powinowactwie. Ponadto, struktury uzyskane zaawansowaną techniką CroEM pozwoliły na potwierdzenie tworzenia kompleksu PAD4-GAG i wskazują na nową organizację molekularną PAD4, najprawdopodobniej odpowiedzialną za wzrost aktywności enzymu. W równolegle prowadzonych badaniach in vitro udało się wykazać wiązanie PAD4 do powierzchni komórek produkujących GAG, a prowadzona we współpracy z partnerem norweskim analiza próbek klinicznych pacjentów wskazuje na korelację podniesionych poziomów GAG w serum z wcześniejszym rozwojem choroby.

Opisanie nowych mechanizmów aktywacji PAD4 ma więc szansę na interpretację w kontekście klinicznym, a uzyskane wyniki naszych badań podstawowych mogą pozwolić na opracowanie lepszych terapii RZS w przyszłości.